Przejdź do głównej treści

Widok zawartości stron Widok zawartości stron

Nawigacja okruszkowa Nawigacja okruszkowa

Nawigacja Nawigacja

Widok zawartości stron Widok zawartości stron

Widok zawartości stron Widok zawartości stron

Nobel 2020 z chemii za nożyczki genetyczne

Nobel 2020 z chemii za nożyczki genetyczne

Tegoroczną Nagroda Nobla z dziedziny chemii przyznano Emmanuelle Charpentier i Jennifer A. Doudnie. Obie panie zostały uhonorowane za opracowanie metody edycji genomu. O komentarz w kwestii tegorocznej decyzji Królewskiej Szwedzkiej Akademii Nauk poprosiliśmy badaczy z Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ oraz Małopolskiego Centrum Biotechnologii.

Dr Jacek Stępniewski i prof. Józef Dulak ( Zakład Biotechnologii Medycznej, WBBiB):

Dokonywanie precyzyjnych zmian w genomie komórki jest niezwykle ważne w biologii molekularnej, umożliwia bowiem tworzenie nowych modeli do badania chorób o podłożu genetycznym, do naprawy mutacji powodujących takie schorzenia, a także do poznawania funkcji określonych genów. Przełomem w tej dziedzinie było opracowanie przez Martina Evansa (Cambridge University) metody izolacji i hodowli mysich zarodkowych komórek macierzystych (ESC, ang. embryonic stem cells) oraz metody wprowadzania zmian genetycznych w tych komórkach z wykorzystaniem rekombinacji homologicznej, którą rozwinęli niezależnie Oliver Smithies (University of Wisconsin) oraz Mario Capecchi (University of Utah). Technika ta polegała na wprowadzenia do ESC sekwencji DNA zawierającej długie odcinki komplementarne do regionu genomu komórkowego, w którym zamierzano wprowadzić określoną modyfikację. Technika ta pozwoliła uzyskać niezliczona liczbę mysich modeli umożliwiających badanie funkcji różnych genów, a także przybliżających molekularne podłoże wielu chorób genetycznych. Martin Evans, Oliver Smithies i Mario Capecchi zostali laureatami nagrody Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny w 2007. Niemniej opracowana przez nich metoda była pracochłonna, czasochłonna i mało wydajna.

Prowadzone równolegle badania wykazały, że pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB, ang. double strand break) znacząco zwiększają wydajność rekombinacji homologicznej. Dzieje się tak ponieważ stanowią one poważne zagrożenie dla stabilności genetycznej komórek i muszą w związku z tym ulec szybkiej naprawie, która może przebiegać poprzez dwa główne mechanizmy. W pierwszym – NHEJ, ang. non-homologous end joining – wolne końce nici DNA są ze sobą z powrotem łączone za pomocą odpowiednich białek naprawczych. Jest to proces szybki, niemniej mało dokładny i najczęściej powoduje wprowadzenie niewielkich zmian genetycznych typu insercji (wprowadzenia dodatkowych nukleotydów) bądź delecji (usunięciu fragmentu nici DNA). Drugi – HDR, ang. homology-directed repair – zachodzi, jeśli w pobliżu znajduje się matryca naprawcza zawierająca sekwencje komplementarną do miejsca, w którym doszło do pęknięcia nici DNA. Oba mechanizmy można wykorzystać do wprowadzania pożądanych zmian w genomie komórkowym. Jak jednak doprowadzić do takiego pęknięcia w określonym miejscu w genomie?

Ta przełomowa i powszechnie stosowana obecnie metoda (...) umożliwia przecięcie podwójnej nici DNA praktycznie w dowolnym miejscu w genomie komórkowym.

Emmanuelle Charpentier i Jennifer A. Doudna zostały w tym roku uhonorowane Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii za rozwój metody CRISPR/Cas9, nazywanej potocznie precyzyjnymi nożyczkami genetycznymi. Ta przełomowa i powszechnie stosowana obecnie metoda odpowiada bowiem na pytanie postawione na końcu poprzedniego akapitu i umożliwia przecięcie podwójnej nici DNA praktycznie w dowolnym miejscu w genomie komórkowym. Nie jest to jedyna ani pierwsza metoda, która dają taką możliwość, niemniej dopiero ona naprawdę zrewolucjonizowała biologię molekularną. Co ciekawe, tegoroczna nagroda Nobla w dziedzinie chemii jest również ukoronowaniem wielu badań innych uczonych, które doprowadziły do wykorzystania systemu CRISPR/Cas9 do precyzyjnych modyfikacji genetycznych komórek. System ten występuje naturalnie u bakterii, będąc mechanizmem odpowiedzi nabytej na zakażenia bakteriofagami, czyli wirusami atakującymi komórki bakteryjne, a jego elementy zostały po raz pierwszy opisane przez Francisco Mojicę (Uniwersytet Alicante w Hiszpanii) prawie trzydzieści lat temu. W toku dalszych doświadczeń udało się dokładnie poznać sposób funkcjonowania tego systemu. Składa się on z regularnie powtarzających się sekwencji palindromowych (czyli złożonych z takiego samego ciągu nukleotydów  czytanych od prawej jak i od lewej strony, np. AATTGGTTAA) oddzielonych od siebie fragmentami DNA pochodzącymi z bakteriofagów, które zakaziły wcześniej komórkę bakteryjną (tzw. lokus CIRSPR, ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats – stąd nazwa ). W przypadku ponownego zaatakowania bakterii przez wirusa dochodzi do ekspresji tego odcinka,  powstaje długa cząsteczka kwasu rybonukleinowego (RNA), obejmująca wszystkie sekwencje powtórzone i  wszystkie sekwencje rozdzielające, która podlega obróbce do dojrzałych CRISPR RNA (crRNA), częściowo komplementarnych do sekwencji bakteriofagów. Proces ten zachodzi w obecności specjalnej cząsteczki RNA, tzw. tracrRNA (trans-activating RNA – odkrytej wcześniej przez Emannuelle Charpentier) i prowadzi ostatecznie do powstania kompleksu z enzymem - nukleazą Cas9, która degraduje obce DNA. Jak widać, w komórkach bakteryjnych system ten opiera się na dwóch oddzielnych cząsteczkach RNA – crRNA, która zawiera fragment komplementarny z docelową sekwencją oraz tracrRNA, która uczestniczy w tworzeniu kompleksu z nukleazą Cas9.

Przełomowym odkryciem Jennifer A. Doudna i Emmanuelle Charpentier było wykazanie, że obie cząsteczki RNA – crRNA oraz tracrRNA - można ze sobą połączyć w jedną cząsteczkę tzw. sgRNA, ang. Single-guide RNA i zaprojektować ją w taki sposób, by łączyła się wybraną sekwencją w genomie komórkowym. Główną zaletą takiego systemu jest prostota z jaką można skonstruować narzędzia do modyfikacji komórek pochodzących z różnych gatunków zwierząt i roślin.  Warto podkreślić, że równocześnie z badaniami wyróżnionych nagrodą Nobla  na podobne możliwości zastosowania CRISPR/Cas9 wskazał w tym samym czasie litewski biochemik, Virginijus Siksnys, który zresztą wraz z Emannuelle Charpentier i Jennifer Doudną otrzymał w roku 2018 nagrodę Kavli – norweski odpowiednik naukowego Nobla. W tym roku Komitet Noblowski zdecydował się nagrodzić tylko obie uczone. Należy także wspomnieć o roli młodych badaczy, współautorów publikacji noblistek, wśród których jest polski naukowiec, dr Krzysztof Chyliński, pracujący wcześniej z prof. Emannuelle Charpentier, a obecnie na Uniwersytecie Wiedeńskim.

Metoda CRISPR/Cas9 znalazła dotychczas olbrzymie zastosowanie w badaniach podstawowych, stając się jednym z najważniejszych narzędzi inżynierów-genetyków. Jej potencjał jest jednak  znacznie większy. Precyzyjna edycja genów ma szanse być wykorzystana  w terapiach dotychczas nieuleczalnych chorób. Rozpoczęły się próby kliniczne zastosowania CRISPR/Cas9 w terapii anemii sierpowatej, niektórych nowotworach. W tym roku rozpoczęła się pierwsza próba kliniczna z wykorzystaniem systemu CRISPR/Cas9 w leczeniu ślepoty wrodzonej Lebera typu LCA10, spowodowanej mutacjami w genie CEP290.  Chociaż  żadna z tych terapii  nie została jeszcze oficjalnie zarejestrowana i dopuszczona do użytku to niewątpliwe szanse na ich zastosowanie są zwiększone dzięki prostocie i precyzji CRISPR/Cas9. Metoda ta  pozwala także na precyzyjną manipulację genomami roślin i służy do uzyskiwania odmian odpornych np. szkodniki czy środki chemiczne. Może być także wykorzystywana do zwalczania zagrożeń środowiskowych, jak np. skutecznej eliminacji komarów-widliszków, roznoszących, jak wiadomo, malarię.  Od czasu publikacji w roku 2012 przełomowej pracy zespołów Emannuele Charpentier i Jennifer Doudny opracowano ponadto wiele modyfikacji tej metody, wykorzystując ją np. do aktywacji ekspresji genów. Zmodyfikowana metoda stosująca niektóre elementy CRISPR/Cas9 pozwoliła na opracowanie bardzo szybkich testów wykrywających zakażenie wirusem SARS-Cov-2.

 W badaniach prowadzonych w Zakładzie Biotechnologii Medycznej WBBiB UJ  wykorzystujemy technikę CRISPR/Cas9 do modyfikacji genomu komórek z określonymi mutacjami, np. w genie dystrofiny, prowadzących do rozwoju dystrofii mięśniowej Duchenne’a (DMD). W naszych badaniach wykorzystujemy także inną wyróżnioną nagrodą Nobla technikę – indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) opracowane przez Shinya Yamanakę (Nagroda Nobla  w roku 2012). Pobierając niewielką (kilka ml) ilość krwi od pacjentów z DMD możemy następnie wyodrębnione z niej białe krwinki przekształcić w laboratorium do iPSC. Za pomocą CRISPR/Cas9 naprawiamy precyzyjnie mutację w genie dystrofiny w iPSC, a następnie różnicujemy iPSC z mutacją oraz po edycji  do różnych komórek.,  np. komórek mięśnia sercowego (kardiomiocytów), które są w sposób szczególny dotknięte przez brak dystrofiny. Badanie tak uzyskanych kardiomiocytów  zdrowych oraz z mutacją w genie dystrofiny pozwala nie tylko na lepsze poznanie mechanizmów choroby ale np., także poszukiwanie leków, które mogą okazać się przydatne w leczeniu zaburzeń funkcji serca u pacjentów z DMD.  

W ZBM WBBiB UJ oraz w Małopolskim Centrum Biotechnologii technikę edycji genów wykorzystujemy także do badania mechanizmów cukrzycy monogenowej HNF1A-MODY. Ostatnio w ramach grantu europejskiego JPND Neurodegenerative Disease Research rozpoczęliśmy badania nad zaburzeniami połączeń nerwowo-mięśniowych w rdzeniowym zaniku mięśni (SMA) oraz stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS).  

Warto zaznaczyć, że eksperymentalne próby terapii DMD zostały już przeprowadzone w USA u myszy oraz psów dotkniętych tą chorobą. Badania takie, w połączeniu z wykorzystaniem opisanego  wyżej modelu „pacjenta na szalce” mogą się przyczynić do szybszego opracowania skutecznych metod leczenia DMD a także innych, dotychczas nieuleczalnych chorób. Tegoroczna nagroda Nobla podkreśla zatem po raz kolejny olbrzymie znaczenie badań podstawowych dla znalezienia skutecznych i bezpiecznych zastosowań odkryć naukowych. 

(Badania w Zakładzie Biotechnologii Medycznej WBBiB UJ finansowane są z grantów MAESTRO, OPUS i SONATA  z Narodowego Centrum Nauki oraz JPND ERA-Net z Komisji Europejskiej/NCN).

Prof. Jolanta Jura (Zakład Biochemii Ogólnej, WBBiB UJ):

Przyznanie nagrody Nobla w dziedzinie chemii dla Emmanuelle Charpentier i Jennifer A. Doudna za opracowanie metody modyfikacji (edycji) genomu było oczekiwane przez środowisko naukowe i w pełni uzasadnione. Opracowanie narzędzia molekularnego do edycji genomu - CRISPR/Cas9 (ang. Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats) potocznie określanego jako "nożyce molekularne" ma bardzo szerokie zastosowanie w badaniach podstawowych oraz aplikacyjnych.

Do tej pory nie było tak doskonałego i łatwego w użyciu narzędzia molekularnego.

Narzędzie to pozwala z bardzo dużą precyzją wprowadzać zmiany w materiale genetycznym (DNA) każdego organizmu. Obecnie narzędzie to służy do uzyskiwania roślin i zwierząt genetycznie modyfikowanych w celach badawczych. Coraz częściej metoda CRISPR/Cas9 stosowana do nadawania pożądanych cech roślinom np. uzyskanie pieczarki, która nie ciemnieje. Duże nadzieje wiąże się z terapią chorób genetycznych. Stosowanie tego narzędzia pozwoli usuwać mutacje będące podłożem chorób genetycznych, np. dystrofia Duchenne’a czy chorób nowotworowych. Do tej pory nie było tak doskonałego i łatwego w użyciu narzędzia molekularnego. 

Dr Rafał Mostowy (Małopolskie Centrum Biotechnologii):

Tegoroczna Nagroda Nobla w dziedzinie chemii trafia do dwóch badaczek, Emmanuelle Charpentier i Jennifer A. Doudna. Badaczki są znane ze swojej roli w rozszyfrowywaniu mechanizmów molekularnych "układu odpornościowego" bakterii, zwanychCRISPR/Cas, i przekształcenia ich w narzędzie do edycji genomu.

Bakterie zachowują genetyczną pamięć o wirusach, które zaatakowały je w przeszłości. Jeśli wirus będzie ponownie próbował zainfekować bakterię, system CRISPR rozpozna go po określonej sekwencji genetycznej i zniszczy.

Bakterie zachowują genetyczną pamięć o wirusach, które zaatakowały je w przeszłości. Jeśli wirus będzie ponownie próbował zainfekować bakterię, system CRISPR rozpozna go po określonej sekwencji genetycznej i zniszczy. W 2012 r. Charpentier i Doudna przechwyciły system CRISPR/Cas9 bakterii gatunku Streptococcus pyogenes. Udało im się też ukierunkować go na określone sekwencje, co uczyniło z niego narzędzie do edycji genomu dużo dokładniejsze i tańsze w porównaniu do poprzednich metod. W ostatnich latach metoda CRISPR/Cas stanowi jeden z najgorętszych tematów naukowych na całym świecie ze względu na jej potencjalne zastosowanie do edycji ludzkiego DNA. Obecnie największą zaletą CRISPR jest to, że umożliwia ona łatwe badanie genów każdego organizmu na świecie, co może wkrótce przełożyć się na powstanie alternatywnych terapii w leczeniu chorób i uzyskanie lepszych upraw.

Polecamy również
Chrząszcz brzmi w trzcinie