Mimo skuteczności szczepionek przeciw SARS-Cov-2 pojawiające się nowe warianty wirusa wymagają poszukiwania kolejnych sposobów przeciwdziałania zakażeniom. Pomocne będzie już samo stosowanie szczepionek genetycznych, opartych na kwasach nukleinowych – czy to mRNA, jak w przypadku produktów Pfizer/BioNtch oraz Moderna czy zbudowanych z DNA wektorów adenowirusowych w szczepionkach AstraZeneca oraz Johnson & Johnson.

W odpowiedzi na pojawiające się warianty wirusa naukowcy mogą dość szybko modyfikować sekwencje kwasów nukleinowych używanych w szczepionkach, zwiększając szanse wytworzenia przeciwciał wobec białku kolca kodowanemu przez zmieniony gen nowych wariantów SARS-Cov-2. Dodatkowe możliwości ograniczania namnażania się tego, ale także innych wirusów, stwarza jednak także inna nowatorska strategia.

Rozpoznawanie sekwencji docelowego kwasu nukleinowego – DNA -  przez komplementarne do niego sekwencje RNA (tzw. crRNA – CRISPR-RNA) jest podstawą edycji genów z wykorzystaniem nukleazy Cas9. Ta technika, „genetycznych nożyczek”, zwana CRISPR-Cas9, zastosowana do manipulacji genami umożliwia precyzyjną modyfikację genomu komórek. Jak wiadomo, odkrywczynie  tej strategii,  Francuzka Emmanuelle Charpentier i  Amerykanka Jennifer Doudna zostały wyróżnione w 2020 roku nagroda Nobla (pisaliśmy o tym w październiku ub. roku). Edycja genów jest już testowana w  terapii np. chorób krwi, jak b-talasemia oraz niedokrwistość sierpowatokrwinkowa (anemia sierpowata). CRISPR-Cas9 pozwala jednak tylko na manipulację DNA, bowiem nukleaza Cas9 potrafi przecinać tylko ten dwuniciowy kwas nukleinowy. Tymczasem, jak wiadomo, SARS-Cov-2, podobnie jak większość znanych ludzkich wirusów (np. wirus grypy czy HIV) to wirusy, których materiałem genetycznym jest RNA. Z pomocą przychodzą tutaj inne odmiany enzymów Cas, w szczególności wywodząca się bakterii Leptotrichia buccalis nukleaza Cas13a. Enzym ten, jak również jego inne warianty wykazują specyficzność wobec jednoniciowego RNA, a nie DNA. Zatem naprowadzenie Cas13 na odpowiednie sekwencje w RNA, np. wirusa SARS-Cov-2 może spowodować jego degradację, a tym samym zapobiec namnożeniu się i zakażaniu kolejnych komórek, czyli w konsekwencji rozwojowi COVID-19.

W opublikowanych ostatnio w Nature Communications doświadczeniach zespół Mohameda Fareha i współpracowników pod kierunkiem Josepha Trapaniego z Uniwersytetu w Melbourne w Australii pokazał możliwość trawienia RNA wirusa SARS-Cov-2 z wykorzystaniem odpowiednio zaprojektowanych sekwencji crRNA. Co ważne, badacze zaplanowali crRNA także w taki sposób, by mogły one rozpoznać określony fragment RNA wirusa nawet w sytuacji, gdy doszło w nim do pewnych zmian nukleotydów – czyli procesu typowego dla powstawania nowych wariantów. Stwarza to szansę na opracowanie odpowiednich koktajli cząsteczek crRNA, nakierowanych nie tylko przeciw białku kolca ale także innym sekwencjom RNA SARS-Cov-2. Zastosowane przez tych badaczy sposoby wprowadzania crRNA oraz nukleazy Cas13 umożliwiły skuteczne ograniczenie namnażania się SARS-Cov-2 w komórkach ludzkich hodowanych w laboratorium, w tym w komórkach nabłonka oddechowego.

Oczywiście badania in vitro są punktem wyjścia, ale konieczne jest opracowanie bezpiecznych i skutecznych sposobów podawania takich nowych leków pacjentom. W tym celu niezbędne są najpierw badania na zwierzętach. Naukowcy jednak nie próżnują. W innej opublikowanej w  czerwcu w Nature Biotechnology pracy badacze amerykańscy z Georgia Institute of Technology oraz Emory University w Atlancie wykazali, że możliwe jest zahamowanie replikacji wirusa grypy u myszy a także wirusa SARS-Cov-2 u chomików. W badaniach tych Emmeline Blanchard i współpracownicy pod kierunkiem Chiary Zurla oraz Philipa Santangelo podawali odpowiednio przygotowanie cząsteczki mRNA nukleazy Cas13a oraz nakierowujące ją sekwencje crRNA w postaci aerozolu do płuc myszy, które uprzednio zakazili wirusami grypy. Udało się ograniczyć rozwój infekcji. U chomików zastosowana strategia była inna  - najpierw zwierzęta wdychały aerozol z cząsteczkami crRNA oraz mRNA kodującym Cas13a, a następnie zakażono je wirusem SARS-Cov-2. Badacze zaobserwowali, że aktywność nukleazy Cas13a ograniczyła o połowę liczbę cząstek wirusa w płucach chomików i zapobiegła utracie masy ciała zwierząt (jest to parametr świadczący o rozwoju infekcji).

Przeprowadzone badania wskazują na to, że strategia ta może być dalej badana i rozwijana pod kątem jej zastosowania u ludzi. W przypadku wirusa SARS-Cov-2 zapewne konieczne będą badania na odpowiednio dobranych modelach zwierzęcych, np. transgenicznych myszach wykazujących ekspresję ludzkiej formy receptora ACE2, przez który SARS-Cov-2 wnika do naszych komórek (myszy normalnie są niewrażliwe na zakażenie tym wirusem). Konieczne będzie sprawdzenie kombinacji różnych crRNA, umożliwiających nakierowanie Cas13 na różne geny SARS-Cov-2, w tym sprawdzenie, czy zaprojektowane cząsteczki crRNA są w stanie rozpoznać nowe warianty wirusa. Badania z pierwszej omawianych tutaj publikacji dają nadzieję, że jest to możliwe.

Możliwość uzyskania kolejnej, specyficznej grupy leków nie tylko przeciw zakażeniom SARS-Cov-2 ale także innym wirusom jest niezwykle ważna. Jak podają bowiem autorzy pracy w Nature Biotechnology, obecnie znanych jest 219 wirusów zakażających ludzi, a z nich 214 to wirusy, których materiałem genetycznym jest RNA. Choroby wirusowe są przyczyną około 6,6% zgonów na całym świecie, a przeciw wirusom mamy jedynie około 90 zarejestrowanych leków i to działających tylko w przypadku dziewięciu rodzajów wirusów. Dostępne są szczepionki jedynie przeciw 15 gatunkom wirusów. Zastosowanie nowoczesnych metod biologii molekularnej i opracowanie skutecznych szczepionek oraz innych leków umożliwiających ponadto ich szybkie modyfikacje w przypadku pojawienia się nowych wariantów tak często mutujących wirusów jak wirus grypy czy SARS-Cov-2 jest niewątpliwie niezbędne. Jak wskazują inne badania oraz analizy bioinformatyczne, kilka odpowiednio dobranych crRNA będzie mogło być stosowanych na ponad 90% znanych koronawirusów.  Oczywiście konieczne są  badania nie tylko skuteczności metody ale i bezpieczeństwa zastosowania bakteryjnego białka Cas13 u ludzi. Może ono bowiem jako białko obce dla organizmu wywoływać odpowiedź immunologiczną. Lokalne podanie krótkotrwale działającego mRNA kodującego ten enzym, tak jak to zastosowali badacze amerykańscy we wspomnianej pracy z Nature Biotechnology może ograniczyć aktywność „genetycznych nożyczek” trawiących RNA wirusów tylko do komórek górnych dróg oddechowych, zapobiegając rozszerzaniu się infekcji. Można przypuszczać, że  o kolejnych etapach tych niezwykle ciekawych badań dowiemy się już niedługo. Być może okaże się, czy różne warianty białka Cas13 (w omawianych tutaj pracach wykorzystano Cas13a, ale w innych pracach pokazano także aktywność Cas13b oraz Cas13d wobec wirusa grypy) będą skuteczniejsze i/lub bezpieczniejsze.  

A wcześniej członkowie społeczności akademickiej UJ będą mieli okazję usłyszeć o wykraczających poza bakterie możliwościach systemów CRISPR-Cas od prof. Virginijusa Siksnysa z Uniwersytetu Wileńskiego, jednego z odkrywców uniwersalności tego systemu, uczonego niestety pominiętego przy ostatniej decyzji Komitetu Noblowskiego. Prof. Siksnys wygłosi 23 września br. wykład plenarny otwierający konferencję jubileuszową Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii. Czytelników tego tekstu pozostaje zachęcić do śledzenia postępów nauki w walce z wirusami i by nie czekając na nowe leki skorzystali, jeśli jeszcze tego nie zrobili, z dostępnych już skutecznych szczepionek anty-SARS-Cov-2, a jesienią zaszczepili się przeciw grypie.

Prof. dr hab. Józef Dulak
Kierownik Zakładu Biotechnologii Medycznej
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ